菌群功能因果性验证怎么做？高高手给你支招！

导语：胃肠道功能障碍是急性高原反应（AMS）的常见症状之一，而肠道菌群与γδT细胞在肠道疾病中发挥重要作用。合作课题组浙江大学附属第一医院李兰娟院士团队和刁宏燕团队在Gut Microbes上发表的一项最新研究结果，在AMS小鼠模型中，不仅发现利用抗生素去除肠道菌群可缓解肠道损伤，而且还通过一系列严谨的实验，从机制上揭示了肠道菌群促进低氧诱导的肠道损伤的原因。

 许多小伙伴都在发现了菌群改变与疾病发生相关性之后，不知道接着再做些什么实验。此项研究工作可作为菌群功能验证实验可以怎么做的范例，值得仔细学习。

论文标题：Phospholipid metabolites of the gut microbiota promote hypoxia-induced  intestinal injury via CD1d-dependent γδ T cells

刊登日期：2022年06月

发表杂志：Gut Microbes

影响因子：9.434

技术手段：16S rRNA基因测序、脂质代谢组

（一）研究背景

急性高原病（AMS）是一种与急性缺氧相关的潜在致命疾病，AMS会引起一些肠道症状，如恶心、呕吐和腹泻。肠道作为身体器官最大的粘膜组织，肠道菌群失调和免疫功能障碍与多种疾病密切相关，然而缺氧诱导的肠功能障碍的机制尚未明确界定。 因此本课题希望探究缺氧诱导的肠道损伤中宿主—微生物群的相互作用，明确来自肠道菌群群的脂质代谢物是否影响免疫细胞的功能障碍从而加剧缺氧诱导的肠损伤。

（二）研究设计

图1 研究设计与流程图

实验分组：

1、缺氧时肠道菌群改变对小鼠肠道损伤的影响

①缺氧时SPF小鼠灌胃复合抗生素或无菌水7天（各6只）；

②常氧时SPF小鼠灌胃复合抗生素或无菌水7天（各6只）；

③移植缺氧和常氧小鼠移植肠道菌群后小鼠表型变化（各6只）；

2、16S rRNA基因测序分析缺氧组和正常组之间群落组成差异

①对SPF小鼠盲肠内容物进行16S rRNA测序（缺氧 VS 常氧，各6只）；

3、构建IL-17A和CD1d缺陷小鼠分析肠道菌群与肠道损伤的分子通路

①野生型小鼠和IL-17A缺陷小鼠各6只（缺氧 VS 常氧）；

②野生型小鼠和CD1d缺陷小鼠各6只（缺氧 VS 常氧）；

4、脂质代谢组学分析缺氧小鼠脂质代谢组检测

①缺氧 VS 常氧盲肠内容物进行测序（野生型小鼠各6只）；

5、灌胃实验

①复合抗生素处理后小鼠灌胃Desulfovibrio piger（商品化脱硫弧菌）或PBS在缺氧条件饲喂（各6只）

②复合抗生素处理后小鼠灌胃Clostridium bolteae（商品化梭状芽孢杆菌）7天后做qPCR分析（0d VS 7d，各6只）

实验方法：

 首先探究在复合抗生素作用下肠道菌群的减少是否可以减轻缺氧引起的肠道损伤和肺水肿—表型变化。为明确肠道菌群在缺氧诱导的肠道损伤中的作用，利用16S rRNA基因测序分析缺氧组和正常组之间群落组分及差异分析；进一步地，使用qPCR、HE染色切片、流式细胞术、ELISA 分析肠道菌群调控免疫细胞发挥作用的分子机制，并结合脂质代谢组学比较缺氧组、正常组的肠道菌群衍生的代谢物差异（脂质抗原）探索肠道菌群-脂质抗原-免疫细胞-IL 17A轴参与的缺氧诱导肠道损伤的分子机制。

（三）研究发现

1. 缺氧时肠道菌群改变加重肠道损伤

图2 肠道微生物群的消耗可减轻由缺氧引起的肠道损伤和肺水肿

作者首先观察表型的变化，采用缺氧（5.0%氧浓度）和常氧（20.9%氧浓度）条件下口服抗生素（4Abx）和无菌水（对照）观察肺部和肠组织的表型变化。结果显示与无菌水饲喂对照组相比，复合抗生素（4Abx）治疗组小鼠肠道损伤和肺水肿程度减弱，只表现出轻微的疾病过程，肠绒毛、炎症细胞浸润和肠壁变薄显著减少，在缺氧时复合抗生素治疗的小鼠对肠道损伤和肺水肿有明显的保护作用（图2a-d）。此外，缺氧期间抗生素治疗组小鼠紧密连接蛋白（claudin-1、ZO-1)表达升高，FITC-葡聚糖（通透性标志物）浓度显著降低，肠道内细胞凋亡明显减少（图2e-h）。与无菌水饲喂对照组相比，缺氧条件下复合抗生素治疗可在一定程度上抑制促炎因子（IL-6和IL-7）水平升高（图2j）。此外，作者进一步检测移植常氧和缺氧条件下粪菌移植后小鼠的表型特征，结果表明移植缺氧小鼠粪便的小鼠具有更严重的肠道损伤，肠细胞凋亡和促炎因子水平升高，肠道紧密连接蛋白减少。以上结果有力证明缺氧时肠道菌群改变可加重肠道损伤，肠道菌群对促进AMS的发展影响重大。

2. 缺氧通过促进血管生成素-4的分泌改变肠道中梭菌属XIVa和脱硫弧菌属的丰度

作者利用16S rRNA基因测序比较常氧和缺氧时小鼠肠道菌群组成差异，讨论肠道微生物群在缺氧诱导的肠道损伤中的作用。在门水平上，缺氧小鼠中厚壁菌门(Firmicutes)的丰度显著增加，同时拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)的丰度降低(图3a)。在属水平上，缺氧组的脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和异孢菌属（Alloprevotella）丰度高于对照组，而梭菌属(Clostridium)的丰度降低(图3a)。聚类结果表明其在属水平上有5个上调属种和9个下调属种（图3c）；另外，作者发现Desulfovibrio在缺氧小鼠肠道中明显升高，而Clostridium XIVa(C. XIVa)则在健康小鼠肠道中富集(图3c-e，图4a），肠道中Desulfovibrio和C. XIVa(包括Clostridium bolteae)的丰度之间存在显著负相关；另有证据表明，C. XIVa可通过诱导产生IL-10的Treg细胞群（调节性T细胞）来抑制肠道炎症，而作为肠道中最丰富的硫酸盐还原菌，Desulfovibrio可通过产生硫化氢和乙酸盐而促进炎症性肠病（IBD）的发生发展。

图3 缺氧利于改变肠道菌群的组成，并与抗菌肽相关

图4 菌群差异分析及相关性分析

另外，作者通过连续7天给缺氧小鼠灌服梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）探讨肠道中Desulfovibrio和C. XIVa的关系（Clostridium bolteae灌服前小鼠灌胃复合抗生素处理）。结果表明C. bolteae灌胃小鼠肠道中Desulfovibrio的相对丰度显著降低，表明C. XIVa可能抑制Desulfovibrio生长（图3f）。测序结果表明在缺氧条件下肠道中C. XIVa丰度显著降低，而增加了Desulfovibrio的丰度，接着作者探讨缺氧如何改变关键菌体的丰度。由于已知共生菌群由抗菌肽（AMPs：具有抗菌活性的碱性多肽）直接调节，作者首先利用qPCR检测了肠上皮层中AMPs的表达。结果显示缺氧小鼠肠上皮层中编码磷脂酶A2（PlA2）和血管生成素-4（Ang4）的mRNA表达上调，而再生胰岛衍生3γ（Reg3g）和再生胰岛衍生的3β（Reg3b）的表达下调（图3g）。此外，Ang4的表达与C. XIVa的相对丰度呈负相关(图3h)，并且Ang4显著抑制了C. bolteae的生长（图3i）。以上结果充分证明缺氧期间肠道中增加的Ang4抑制了C. XIVa的生长，从而削弱了对Desulfovibrio的抑制作用，导致Desulfovibrio丰度增加。

3. γδ T细胞衍生的IL-17A促进缺氧诱导的肠道损伤

图5 小肠上皮细胞中γδ Τ细胞的增殖和激活以及IL-17A的产生促进缺氧诱导的肠损伤

IL-17 是T 细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，不仅可以通过促进释放炎性细胞因子来放大炎症反应，还可以通过调节细胞介导的免疫应答参与针对感染的保护性免疫。肠道菌群可以诱导IL-17A的表达，但其在缺氧诱导的肠道损伤中的作用尚未明确，本文已证实缺氧小鼠肠道中IL-17A的产生显著增加（图1j）。为证明IL-17A可能在缺氧介导的肠道损伤中发挥作用，作者通过构建IL-17A缺失小鼠在缺氧条件下表现出肠道损伤显著减少，紧密连接蛋白水平增加且血清中游离甲状腺素（FD4）和脂肪酶（LPS）水平显著降低（图5a-d）。

为进一步探索缺氧诱导的肠道损伤中肠道菌介导的免疫机制，作者通过流式细胞术分析了缺氧和常氧小鼠小肠上皮层中产生IL-17A的免疫细胞。结果显示，缺氧小鼠肠道中γδ T细胞的丰度显著增加，且γδ T细胞仅在小肠上皮层显著增加，但辅助性T细胞17（Th17）、自然杀伤细胞（NK）和NKT细胞的比例没有差异（图5e）。此外，与常氧小鼠相比，缺氧小鼠小肠上皮层γδ T细胞的活化标志物（如CD44和CD69）升高（图5f）。γδ T细胞的增殖和激活显示出强大的IL-17A生成能力（图5g）。与常氧小鼠相比，缺氧小鼠肠上皮中较高比例的γδ T细胞对RORγt呈阳性，RORγ是γδ T细胞分泌IL-17A的关键转录因子(图5h)。缺氧后IL-17阳性细胞中缺氧后IL-17阳性细胞中CD4⁺ T、CD8⁺ T、NKT和NK细胞的比例无明显变化。γδ T细胞是缺氧小鼠小肠中IL-17A的最高产生者（图5i）。当作者在小鼠处于缺氧条件之前注射抗γδ T细胞的单克隆抗体，结果显示γδ T细胞有效抑制肠道损伤的进展。以上结果证明γδ T细胞是急性缺氧时IL-17A的主要产生者，其在肠上皮层聚集可加重缺氧诱导的肠道损伤。

5. 脱硫弧菌属可激活γδ T细胞产生IL-17A

图6共生微生物诱导γδ T细胞增殖和IL-17A产生

前文作者利用16S rRNA基因测序比较常氧和缺氧时小鼠肠道菌群组成差异，通过分析发现Desulfovibrio的丰度与γδ T细胞的比例及IL-17A的产生显著正相关，与C. XIVa呈负相关(图6a-b)。作者使用复合抗生素对小鼠肠道菌群进行清除以探讨肠道菌群是否会影响γδ T细胞的增殖和IL-17A的产生，经抗生素处理的小鼠中γδ T细胞比例和IL-17A的产生均显著降低(图6c-d)。与PBS处理的对照小鼠相比，灌胃Desulfovibrio piger（D. piger：商品化脱硫弧菌）的小鼠γδ T细胞比例更高，IL-17A产量更高（正式实验前小鼠灌胃复合抗生素处理）。此外，D. piger刺激后γδ T细胞IL-17A的比例显著增加(图6e-f)。因此，在急性缺氧期间，肠道中的Desulfovibrio可促进γδ T细胞增殖和IL-17A分泌，从而加重缺氧诱导的肠道损伤。

6. 脱硫弧菌以CD1d依赖性方式激活肠上皮内γδ T细胞

图7 共生微生物群以CD1d依赖性方式激活肠上皮内γδ T细胞

γδ T细胞可通过不同的方式被微生物激活，包括细菌直接刺激或CD1d分子呈递的细菌脂质抗原识别，为探索Desulfovibrio激活肠上皮内γδ T细胞的机制，作者构建了CD1d缺陷小鼠AMS模型，结果表明CD1d缺陷小鼠对缺氧引起的肠道损伤和肠道屏障破坏具有部分抗性(图7a-b)。同时，与野生型小鼠相比，CD1d缺陷小鼠缺氧时血清FD4和LPS水平显著降低(图7c-d)。在缺氧条件下，与野生型小鼠相比，CD1d缺陷小鼠的γδ T细胞比例降低，IL-17A产生减少(图7e-f)。另外，在缺氧小鼠和常氧小鼠之间，CD1d表达细胞中CD45阴性细胞（代表上皮细胞）的比例均高于CD45阳性细胞（代表上皮内白细胞）且对应的细胞数量同样表现相同趋势(图7i)，表明小肠上皮细胞中表达的CD1d可能在缺氧诱导的肠道损伤中起着不可替代的作用。此外，用D. piger处理后的野生型小鼠小肠上皮总细胞中，γδ T细胞的比例显著增加(图7k)。以上结果表明，Desulfovibrio主要通过CD1d信号介导小肠上皮γδ T细胞的增殖和活化。

7. 脱硫弧菌衍生的脂质抗原PE或PC与γδ T细胞增殖和活化相关

图8 脱硫弧菌衍生的脂质抗原PE或PC与γδ T细胞增殖和活化相关

γδ T细胞可被CD1d分子呈递的细菌脂质抗原识别，作者为探索缺氧条件下影响上皮内  γδ T细胞增殖和活化的关键因素，通过脂质代谢组学进一步分析肠道内CD1d相关脂质抗原以阐明在缺氧条件下影响上皮内γδ T细胞增殖和活化的关键因素，结果显示缺氧组和常氧组之间的脂质代谢产物存在显著差异(图8a-b)。细菌能够产生脂质抗原（PE和PC：磷脂类物质），可结合CD1d诱导γδ T细胞的增殖和活化，作者利用代谢组学及ELISA实验比较了缺氧和常氧小鼠盲肠内容物中PE和PC的表达水平（利用双抗体夹心法ELISA检测脂类抗原），结果表明缺氧小鼠肠道中PE和PC表达显著增加(图8c-f）。缺氧小鼠在外源性脂质抗原PE或PC作用后，肠上皮内γδ T细胞数量和IL-17A产生水平在Abx（复合抗生素）处理的野生型小鼠体内得以恢复，但在Abx处理的CD1d缺陷小鼠中没有恢复(图8g-h)。另外，与缺氧条件下的变化一致，常氧条件下野生型小鼠腹腔注射PE或PC后，上皮层细胞因子IL-6和IL-17A的表达显著增加，表明PE和PC可以结合CD1d诱导促炎反应，加重肠道损伤(图8i)。

图9 肠道菌群与脂质抗原相关性分析

16S rRNA基因测序和脂质代谢组学联合分析说明Desulfovibrio与脂质抗原PE或PC呈显著正相关（图9c）。另外，为探究在缺氧条件下Desulfovibrio丰度与PE或PC激活γδ T细胞的能力，作者以Desulfovibrio 丰度最高的D. piger为例，检测了D. piger的脂质代谢物含量，结果表明在缺氧条件下，肠道中Desulfovibrio增加提供了更多可由CD1d呈递的PE和PC，促进γδ T细胞的增殖和IL-17A的产生，从而加剧缺氧诱导的肠道损伤。

（四）研究结论

肠道菌群衍生的代谢物可通过CD1d依赖性γδ T细胞促进缺氧诱导的肠道损伤，表明磷脂代谢物和γδ T细胞可作为AMS的治疗靶点。

编者小评：

本研究以16S rRNA基因测序和脂质代谢组联合分析为关键枢纽，探究肠道菌群衍生的代谢物与缺氧诱导的肠功能障碍的调控机制。实验设计从表型出发并建立CD1d和IL-17A缺陷小鼠AMS模型，利用多种检测手段验证多组学因果关系，严谨地将肠道微生物代谢物影响肠道损伤的具体过程展现在读者面前，整体的实验思路值得借鉴。

总结：

相关阅读

点击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由